THERAPEUTIC BACTERIOPHAGE COMPOSITIONS

Abstract

The present invention relates to a bacteriophage composition comprising one or more (suitably two or more, or three) bacteriophages selected from Sa87, J-Sa36, or Sa83, or mutants thereof. Also encompassed are the use of said bacteriophage compositions for medical or non-medical applications, as well as kits, bandages, and wound dressings comprising said bacteriophage compositions.

Claims

1. A bacteriophage composition comprising one or more bacteriophages selected from Sa87, J-Sa36, Sa83, and mutants thereof.

2. A bacteriophage composition according to claim 1 comprising at least two bacteriophages selected from Sa87, J-Sa36, Sa83, or mutants thereof.

3. A bacteriophage composition according to claim 1, comprising bacteriophages Sa87, J-Sa36, Sa83, or mutants thereof.

4. A bacteriophage composition according to claim 1 consisting essentially of Sa87, J-Sa36, and Sa83, or mutants thereof.

5. A bacteriophage composition according to claim 1, wherein the mutant has at least 75% sequence identity across its entire genome when compared to Sa87, J-Sa36, or Sa83.

6. A bacteriophage composition according to claim 1, wherein the mutant has at least 80% sequence identity across its entire genome when compared to Sa87, J-Sa36, or Sa83.

7. A bacteriophage composition according to claim 1, wherein the mutant has at least 90% sequence identity across its entire genome when compared to Sa87, J-Sa36, or Sa83.

8. A bacteriophage composition according to claim 1, wherein the mutant has at least 95% sequence identity across its entire genome when compared to Sa87, J-Sa36, or Sa83.

9. A bacteriophage composition according to claim 1, further comprising an antibiotic (e.g. a chemical antibiotic).

10. A bacteriophage composition according to claim 1, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient or combinations thereof.

11. A bacteriophage composition according to claim 1 for use as a medicament.

12. A bacteriophage composition according claim 1 for use in treating a bacterial infection.

13. (canceled)

14. A method of treating a bacterial infection comprising administering the bacteriophage composition according to claim 1 to a subject.

15. A method according to claim 14, wherein the bacterial infection is a Staphylococcus aureus bacterial infection.

16. The method of claim 15, wherein the bacterial infection is a pulmonary bacterial infection.

17. The method of claim 16, further comprising administering an antibiotic (e.g. a chemical antibiotic) to the subject.

18. A kit comprising: a. a bacteriophage composition according to claim 1; and b. instructions for use of same (e.g. in medicine).

19. A kit according to claim 18 further comprising an antibiotic (e.g. a chemical antibiotic) and instructions for use of same in combination with the bacteriophage composition.

20. A kit according to claim 18, wherein said instructions are for use of same in treating a Staphylococcus aureus infection, preferably a Staphylococcus aureus pulmonary infection.

21. A method of killing bacteria on a surface, said method comprising applying a bacteriophage composition according to claim 1 to the surface.

22. A method according to claim 21, wherein the surface is the skin of a mammal, equipment (suitably medical equipment), bedding, furniture, walls, floors, or combinations thereof.

23. The kit according to claim 18 for a non-medical application.

24. A bandage or wound dressing comprising a bacteriophage composition according to claim 1.

Description

FIGURES

[0094] Embodiments of the invention will now be described, by way of example only, with reference to the following FIGURE, in which:

[0095] FIG. 1 shows efficacy of a phage panel vs. vancomycin in a S. aureus pneumonia model: statistical analysis of dosage groups. Statistical analysis was performed using Tukey's multiple comparisons test (Graphpad Prism 6, La Jolla, Calif.). Only groups demonstrating a significant difference in the pairwise comparisons are shown (p<0.05). Where two groups are compared to a third, the p value presented is the higher of the two pairwise comparisons. **p≤0.001, *p≤0.05.

EXAMPLES

Example 1

[0096] Assembly of a Bacteriophage Panel

[0097] A composition (panel) of four bacteriophages Sa87, J-Sa36, J-Sa37 and Sa83, which together had broad activity against a panel of recent diverse S. aureus clinical isolates (unpublished data), was used for animal studies. In an exemplary method, phage lysates were prepared using manufacturing hosts SPS1216 and SPS1226, which do not release endogenous prophage during the production cycle. Cultures were grown in bioreactors to an OD.sub.800 0.2 prior to phage addition. Incubation at 37° C. was continued and absorbance read at least every 60 minutes. Cultures were harvested after bacterial lysis, and impurities separated from the phages with several filtration steps followed by chromatographic steps that enabled reduction of debris such as host cell proteins and host cell DNA. After purification, lysates were additionally concentrated using spin columns (Amicon® Ultra 15-100 kDa, Merck Millipore, Darmstadt, Germany) such that final phage titers were ≥1×10.sup.11 PFU/mL. At the end of the process, buffer was exchanged and all material was filter-sterilized (0.22 μm filter) and stored at 2-8° C. Plaque assays were used to titer the phage stocks (Carlson, K., In E. Kutter and A. Sulakvelidze (ed.), Bacteriophages: Biology and Application, (2005) 437-494, CRC Press, Boca Raton, Fla., Hyman, P., et al., Meth. Mol. Biol. (2009) 501:175-202). The four purified phage samples were combined such that each phage was present in the final panel at a concentration of 2×10.sup.10 PFU/mL per phage and then additionally diluted 1:10 or 1:100 to obtain the 3 dosing solutions. Final endotoxin levels were <1000 EU/mL, which was acceptable for animal studies.

Example 2

[0098] Bacterial Strains

[0099] Frozen stocks of Staphylococcus aureus UNT109-3 and UNT144-3 (obtained from the UNT culture collection) were inoculated into Trypticase™ Soy Broth (BBL™ Laboratories)+5% defibrinated sheep blood (TSBb) and incubated for 18 hrs at 37° C. (shaking). After 18 hrs the culture was diluted 1:10 into fresh TSBb and incubated for a further 5 hrs before being diluted in fresh TSB for inoculation into the mice.

Example 3

[0100] Assessment of S. aureus Virulence in the Murine Pneumonia Model

[0101] The sensitivity of two S. aureus clinical isolates, UNT109-3 (NRS234, native valve endocarditis) and UNT144-3, that have been previously utilized in animal models of infection, was evaluated vs. the individual phage and the 4-phage panel. In some embodiments, both strains were fully sensitive to the panel as well as the individual phage Sa87, J-Sa36, and Sa83. Phages Sa87, J-Sa36, and Sa83 demonstrated improved efficacy against UNT109-3 when compared to phage J-Sa37. The virulence of the two strains was then evaluated in the murine lung infection model. Female Hsd:ICR(CD-1) mice (Harlan Laboratories, Houston, Tex.) were administered 150 and 100 mg/kg cyclophosphamide on day −4 and day −1 prior to infection to render them neutropenic. Groups of 5 mice were then anaesthetized by intraperitoneal (IP) injection of 0.15 mL of a mixture of ketamine HCl (100 mg/kg body weight) plus xylazine (10 mg/kg body weight). Once anaesthetized, mice were infected intranasally by placing drops on the external nares and allowing inhalation of the 50 μl inoculum. Twenty-four hours after infection, mice were euthanized by CO.sub.2 inhalation and lungs processed for bacterial titers. Bacterial counts were enumerated on Brain Heart Infusion agar (Difco™ Laboratories)+0.5% activated charcoal (Sigma-Aldrich) plates for ease of recovering and detecting S. aureus (Barr, J. G., et al., J. Clin. Pathol. (1987) 40:372-376). Mice that had received 7.13 log.sub.10 CFU of strain UNT109-3 all succumbed to the infection prior to the 24-hour harvest, indicating unsuitable virulence. All mice infected with 6.95 log.sub.10 CFU of strain UNT144-3 survived until sampling, and exhibited mean log.sub.10 CFU/lung pair titers of 6.78±0.34 and 8.17±0.91 and 2 and 24 hours post-infection, respectively. These data indicate that the virulence of the UNT144-3 strain, both in terms of lung titers and survival, is comparable to historical results obtained for other MRSA isolates (unpublished data). Based on these results, UNT144-3 was selected for use in the efficacy studies.

Example 4

[0102] Efficacy of the 4 Phalle Panel in the S. aureus Pneumonia Model

[0103] Six groups of 5 mice were rendered neutropenic as described above. Once anaesthetized, an inoculum of 6.98 log.sub.10 CFU in 50 μL of strain UNT144-3 was delivered intranasally, resulting in mean bacterial lung titers of 7.24 log.sub.10 CFU/lung pair at 2 hrs, which increased to 9.18 log.sub.10 CFU/lung pair at 24 hours in the untreated control group (FIG. 1). 100 mg/kg Vancomycin was administered as a subcutaneous injection 2 hr and 6 hr post-infection; PBS-Mg diluent was delivered intranasally at 2 hr and 6 hr post-infection to the untreated control group.

[0104] Three phage panel treatment groups were evaluated for efficacy: 2×10.sup.10 PFU/mL per phage, 2×10.sup.9 PFU/mL per phage, and 2×10.sup.8 PFU/mL per phage. As described below, 50 μL doses of phage were administered at both 2 hr and 6 hr post-infection, such that each mouse received 1×10.sup.9 PFU of each phage, 1×10.sup.8 PFU of each phage, or 1×10.sup.7 PFU of each phage at each time point, according to its dosage group. At the time of the first administration of 50 μL phage, the colony counts in the lung were 7.24 log.sub.10 CFU/lung pair. Thus, the multiplicity of infection was ˜60 , ˜6 and ˜0.6 for the 3 dosage groups at the 2 hr time point when the first phage dose was administered.

[0105] Administration of two doses of the phage panel resulted in S. aureus lung titers of 6.08, 6.16 and 7.8 log.sub.10 CFU/lung pair for the 1×10.sup.9 PFU/phage, 1×10.sup.8 PFU/phage, and 1×10.sup.7 PFU/phage treatment groups, respectively. These correspond to 1.38-3.1 log.sub.10 CFU reductions compared to the 24 hr vehicle control group and 1.08-1.16 log.sub.10 CFU reductions for the 1×10.sup.9 PFU/phage and 1×10.sup.8 PFU/phage groups compared to bacterial titers at 2 hrs post-infection. FIG. 1 shows a comparison of the different treatment groups that demonstrated statistical significance as determined by ANOVA analysis (Tukey's multiple comparisons test). The 1×10.sup.9 PFU/phage, 1×10.sup.8 PFU/phage, treatment groups demonstrated a significant reduction in lung CFU vs the 24 hr non-treated control (P<0.0001 for both). Vancomycin administration (100 mg/kg SC at 2 and 6 hrs) resulted in 24 hour bacterial lung titers of 5.55 log.sub.10 CFU, similar to the two highest phage doses (no significant difference between those 3 groups was observed).

Example 5

[0106] Analysis of Colonies Resulting from Mouse Lung Homogenates after Infection

[0107] A total of 27 S. aureus colonies recovered from the murine lung infection model were evaluated for sensitivity to the individual phage components (Sa83, Sa87, J-Sa36, J-Sa37) and to the 4-phage panel. Colonies from the 2 hr untreated cohort appeared homogenous on the BHI-charcoal plates; thus a single colony was isolated from each of 3 different mice. In some cases, both normal and translucent colonies were observed and therefore both colony types were evaluated from 3 different mice per group (e.g., 24 hr untreated and vancomycin groups). Four colonies from each of the three S. aureus morphotypes seen among phage-treated groups were also evaluated (total 12): these included colonies with a typical S. aureus morphology as well as translucent colonies. Spot tests were performed on lawns of the 27 recovered colonies in order to assess phage sensitivity to the 4 individual phage and the phage panel using 5 μL spots of the neat, 10.sup.−1, 10.sup.−2, 10.sup.−3, and 10.sup.−4 serial phage dilutions (Carlson, K., supra, Hyman, P., supra). Testing was performed in triplicate. Susceptible control strains (SPS1216 and SPS1226) were run in parallel. Bacteria were considered sensitive if a visible clearing of the bacterial lawn, that was attributable to productive phage infection, was observed (e.g., consistent scoring or progression to individual plaques in serial dilutions). The 27 colonies demonstrated equivalent sensitivity to UNT144-3 for the phage panel as well as three individual phage Sa83, Sa87 and J-Sa36.

[0108] In this study, we demonstrated that the efficacy of a phage panel at 1×10.sup.8 PFU/phage (MOI of each phage˜6 at the time of the first dose) and 1×10.sup.9 PFU/phage (MOI of each phage˜60 at the time of the first dose) was comparable to vancomycin dosed at 100 mg/kg SC. Additionally, the S. aureus isolates that were re-isolated from infected mice remained sensitive to the phage panel. These data provide a first step in the evaluation and development of a phage therapeutic, including initial assessment of the dosing regimen.

TABLE-US-00001 TABLE 1 S. aureus Neutropenic Lung Model CFU Dose OR Titer Assessed Group # Mice Test Article Route (BID) (Time) 1 5 Phage IN 1e9 PFU/phage 24 hr 2 5 1e8 PFU/phage 3 5 1e7 PFU/phage 4 5 Vancomycin SC 100 mg/kg 24 hr 5 5 Untreated — — 24 hr 6 5 — —  2 hr

TABLE-US-00002 TABLE 2 Evaluation of 4 phage panel vs vancomycin CFU Assessed Mean ± SD log.sub.10 Dose OR Titer (Time) CFU/Lung Pair 1e9 PFU/phage BID 24 hr 6.08 ± 1.04 1e8 PFU/phage BID 24 hr 6.16 ± 0.89 1e7 PFU/phage BID 24 hr  7.8 ± 0.45 Vancomycin 24 hr 5.55 ± 1.1  Infected, untreated 24 hr 9.18 ± 0.32 Infected, untreated  2 hr 7.24 ± 0.12

Example 6

[0109] Assembly of a 3 Phalle Bacteriophage Panel

[0110] A number of bacteriophages (including Sa87, J-Sa36, Sa83, and J-Sa37) targeting Staphylococcus aureus are grown on permissive host strains and then tested against a range of S. aureus strains by: spot testing on bacterial lawns, enumerative plaque assay and broth culture using a plate reader assay system. The plate reader monitors the optical density of a broth culture containing bacteriophages with a suitable host in a multi-well plate format. This latter method allows detailed kinetics of the infection process to be evaluated. Bacteriophages showing good plaque formation are selected.

[0111] Candidate bacteriophages are propagated in liquid (broth) culture and lysates prepared. Clarified lysates are purified by centrifugation through a sucrose cushion (27 ml of each lysate is carefully over-layered onto 5 ml of a sterile 10% w/v sucrose ‘cushion’, in 36 ml polypropylene tubes prior to centrifugation).

[0112] The individual bacteriophages (including Sa87, J-Sa36, Sa83, and J-Sa37) are then retested both individually at higher MOI (multiplicity of infection [ratio of infecting bacteriophage to bacterial host cells]) and as a mixture. The results of this testing are surprising, bacteriophages Sa87, J-Sa36, Sa83, J-Sa37 produce effective reduction of bacterial host numbers with very limited development of resistance when each bacteriophage is tested in isolation. However, when a mixture of all four bacteriophages (Sa87, J-Sa36, Sa83, J-Sa37) is used, development of resistant forms is more rapid than when the bacteriophages are used in isolation, indicating antagonistic effects in the mixed bacteriophage infection that permit enhanced bacterial escape.

[0113] Further testing clarifies that bacteriophage J-Sa37 appears to be antagonistic to the effects of bacteriophages Sa87, J-Sa36 and/or Sa83 in reducing the development of bacterial resistance (as is measured by optical density at OD600) illustrating the antagonistic effect of J-Sa37. An improved bacteriophage composition is provided having bacteriophages Sa87, J-Sa36 and Sa83 which demonstrates enhanced therapeutic efficacy when tested using the pneumonia model (see Examples 3-5).

Example 7

[0114] Preparation of Mutants of Sa87, J-Sa36 and Sa83

[0115] Bacteriophages Sa87, J-Sa36, and Sa83 are iteratively passaged with S. aureus strains using conventional techniques (see for example Kelly et al, (2011), Bioengineered Bugs, 2:1, 31-37, which is incorporated herein by reference). Escape phages capable of lysing S. aureus strains previously resistant are selected. Genetic mutation of said escape phages compared to bacteriophages Sa87, J-Sa36, and/or Sa83 is confirmed by genetic sequencing. The escape phages are selected for inclusion in a bacteriophage composition comprising Sa87, J-Sa36, and/or Sa83 based on the methodology of Example 6. The bacteriophage composition demonstrates similarly enhanced therapeutic efficacy to the composition having bacteriophages Sa87, J-Sa36, and Sa83 when tested using the pneumonia model (see Examples 3-5).

Sequences

[0116]

TABLE-US-00003 SEQ ID No. 1 GGATTTGATTATTATGACAAATACAATACAAGCATTTTTACAAGGACAAG AAGCAAGCACAGTTAAGGACGTAGCAACTCATGGAGTACAAAGCGGAGCA ATTGGCAAATTAATCTACACATCAGACGTAGTAAACTTCTTTGATAGTTA CGAGCAGGACATTGAAGCGGTCATCACTGAATACATTGAAGAGGTTACAG GACAACAATATTATGACTTATTGAACTATGAGCTTATGAGAGACCTCGAG AATTATGCAAATGTAGAATTTGAAGACGAAGACGAATATAATAACATTCA ATTTGACCTAGCAGAAAACATTGCTTCTGATGAGGTTGAAGGATTTGAAG ACATGGACGAAGCAGACCGGGCGGAAGCAATCTATGAGGCTATGGATGAT GTTGAATTAGAACTACAAGAAACTGACAAGGTTCAATATGTTAATCTAGC GGTTGAGATTGTAGCTCAAAGAATGGCACTATAGAAAGCACACAGAGAAG CTTAACCGCTTCTCTAATACAATTAATCAGGAGATGTTGAAGATGAATAC AAGACGGGTAAACAGAGCGTTAAACGAAGCAGTTAGATTATTAGATGAAC AAATAGCAGATACTCAAAAGACTATGCAGGAGTTGAATAAACAACTAGAG AAGCAAATAAAGGCTAAGCAAGAGCTAATGGTATTAGTTGATGTTATGAA TGGTGATGATGAGTAATGAACATTAGAGAGGTTCACAATGTCGTTAAGAG TGCTAAGAGCAAACTCCTGCAGGAGCAGGCTCACCCAACGGATAACCTCA TAGAGCAGTACATCAATGATGAGCTACACAGACGCACACAGAGAAGCGGA ACAATACAGATGAACAATAATACTACTTCATATAGTAATAGCCCATATGG TAGCTTAGAAGAGCTTAGAGAAGCTTATGACCTATCGTCATTATCTACTG GTGAGATTAAAGAACTAATACAAACATTTGTTTAAATTATTTTATCAAAA CGCTTTACAATCTTTTAGTTTGTATGATATAATGAACTTAACAAATTAAA AGAAAAGGAAATGATGAACATGACAAACTTACAAGAAAGAAAACAAGAAT TGAAAACGTTACTATTTAACTTAGCTTTAGAGAAGAACAAAGCAACTGAT GAGACACTGCTTAGCGTATTAGAGCAAGCACATCAAGAGGTAGGAAATCA ATTAAGAAAAGTAAGAAAAGAAATAGAAATTTTAGTAGAAGAAAAAGAAA GGGAATTTTGGAATGATATCGAATTTAATGGATTAGACTAAGAGGGAATA AAATCCCTCTTTTATTTTTATCCTATTATATAATTTTTTTATATTATACG GGGGCAGGGGTAAAATGCCACTCAATGGGGGTGGGTCTATATACCCCTAT GGTCTACCCAGGTACTTATTTTTTGGGGAAAATTATGAAAATAAATATTT AAAAGTCAACACCTAAAATATAGAACGTAAGTCAACACCCTATATTAAAA GTCAACAATTTATAGTACAAATAGAGAACCTCTAAATATAAAGTCAACAT ATCTAAAATAAGAAAGAGGGAAATTAAATCCCTCCTCTTAGGTATTATTA ACAACCTCTAATTCATGTATAGTAATCATATCCATCCCATAGAAATCTCT TGGGTCTCCTTTAATGAACTCTTGCTCTCCTCTATGGTTTGTTTCCTCTT TATAACCTTCTTCTTTAATACGTTTAATTAAGTTCTCCTTATCTGTATAT ATCTTATCTTCTCTAAAATGGAAGTTATCTTCATAAGGTTCACAATTATC ATGTTCTACTTGGTATAGTTTCATTAGTCATTTTCCTCCTCTTCGTAAGA CCATGTACCATATTCTGCATTATAGTGTGCTGTATCTGCGCCTTCATCTT CATATTCTACACTATACCATGCATCCTCCTCTGTTTCTGCATCTATATAT CTTACCTCTTCTGTAGTAATAGTACGTTTTACTTTGTATCTCTTCAACTG TTTTTACTCCTTTATATTTTCCTCTAGTATTTGTTTTAATGTCTGACAGT CTTTTTGGTCTAGAGTATCCCAACTCTCTAAATTTTGTAATTGGTATAGT AACTCATTTACAATTTCATCGAAGGCTTCTGCTTTTTTATATACTTCTTC TAGTTCTGTTTCTGCTAATTTTCTATTCCTTTTAATTTGTTCTGCTTTAG CTACTAAGATATGGGCTTTATTCATTTCCTCTATAATAAAGTTTTTATAG TTTTCCATTATTATTTATCCCTCCTATTTTCTATCCGTTGTTTTATCTCT TCTCTATTGCGGTGGTGCTCCTTACTCATTTCTTTACGTTCCTTATTTGT TAACCTTATCCTATAAACAAGGTAGTTAATGTATAAGATACCGGCTGACC ATAGTAGCAAGAATGATATTAAATAAGTCCATGAGATACTAATTTCTATC ATTGTGAGTCCTCCTTATATTCTTTATAGCTCTTAATGGCTATTTTACAA ATACCTCTATTTACAGCAACAAATACTATAAATGATAATAGTGTTATAAC TGCTCTTACATCCCCTGTAAAAGGTAATGATTGAAAGAGCAAATAGTTTT CTAAAACACTAATAGCTGTAATAGTAGTTAGATATAATATAGATAATAAG TAATCCTTTAATTTTAGTTTAACAAATGGTTTTTTGTGCTCACCTGTTCT TACAATACCATAAAGTATTATGAACCACATAACAGGTACTAACTGTATAA TAAAATCATTGTCTACATTTAATGCATGTAGAGCGTAAATAATAACTGCA GGAATACCTATAATGAATGCTAGAAATACATAAAATATAATTAACATTAT AGGAAGGGCTACAAGAAAACCTAGACCTTGTTTTGAATACTCTAATGTGT TTTTACCTAGGAACTTAAAAAATGTTTTATTCATCTTCTTCCTCCTTGGA ATTACTTTCTGTAATTGTAATTTCTAACATATTATTGTAATAATCATTCT TTTGATTGATATTATAGTTATCATTGTATTCATTAAAGTCTACATAAATA TATTCATTTGCGTCATTTTCATAAATAATATCTATAGCTGTAATATCTGA ATATGCTGTAATCATTTCATAAGCGTTCGTATTATCAGGATAAGCAAAAC CAACTTGAGGTATTTCCATAGGCTTATCAATAAGAATACCGAAATAAGTA CAGTGACGTGTTCGACTTATACTTGAAGTCCCTTTATATGTACCATAGTA ATCTATACCTTCTGTAATACCTGATATATGGAACCTGCTTACGTCTTTAG GCTCTAATCTTACAACATCGCAATTCTCTAATACTAAATCAATATATTTG ATATTCATTTTAACTCTCCTTTTATATTAATAATTTTTTCCATTCTTTAT CAACCTTTTTAAGTTCTTTTTTATTATAGTCCCCGTCTTTAGTTACTACA GTGTTCCATTGGAACTTTTGTAATAAGCTAAAATTATTTATAATCCATAT ATTACTTTTACTATAATACATATTGTCTTCAAATCTTATATCTTTTTCTA TAAAATATTTATATATTTTATATCTTCTTTCATCTGCACCTGATATTTTA ATAATTTCATTAGTATTTAATTGAGTGGATAACTGGAAGATAACATCTTT TACTTTCAATAGGTCTTTAACATTACCTCTGCCTACATGGTCATTATAGC AATCATATTTAACTTTTTTCTTTTGTTTTCTATCATTAACTACAATGAAT ATATTATATACGATATAAGCTTTAAAATGGGTATAGGTAGTAGGTGCTTC 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[0117] All publications mentioned in the above specification are herein incorporated by reference. Various modifications and variations of the described methods and system of the present invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and 55 spirit of the present invention. Although the present invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in biochemistry and biotechnology or related fields are intended to be within the scope of the following claims.