METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT DKIPPING OF EXON 45 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA

Abstract

The invention relates to a method for inducing or promoting skipping of exon 45 of DMD pre-mRNA in a Duchenne Muscular Dystrophy patient, preferably in an isolated (muscle) cell, the method comprising providing said cell with an antisense molecule that binds to a continuous stretch of at least 21 nucleotides within said exon. The invention further relates to such antisense molecule used in said method.

Claims

1. A molecule that binds to a continuous stretch of at least 21 nucleotides within exon 45 of DMD pre-mRNA, wherein the molecule comprises or consists of a 2′-O-alkyl phosphorothioate antisense oligonucleotide sequence selected from SEQ ID NOS: 9-67.

2. The molecule according to claim 1, whereby said molecule binds to a continuous stretch of at least 25 nucleotides within said exon.

3. The molecule according to claim 1, whereby said molecule comprises an antisense oligonucleotide of between 21 and 30 bases.

4. The molecule according to claim 1, whereby said molecule comprises an antisense oligonucleotide of 25 bases.

5. The molecule according to claim 1, whereby said molecule binds to a continuous stretch of at least 21 nucleotides within the following nucleotide sequence: 5′ - CCAGGAUGGCAUUGGGCAGCGGCAAACUGUUGUCAGA ACAUUGAAUGCAACUGGGGAAGAAAUAAUUCAGCAAUC - 3′ (SEQ ID NO: 2).

6. The molecule according to claim 1, comprising a 2′-O-methyl phosphorothioate ribose.

7. A viral-based vector, comprising an expression cassette that drives expression of the molecule as defined in claim 1.

8. A pharmaceutical composition comprising the molecule as defined in claim 1, a pharmaceutically acceptable carrier, and optionally a molecule having a base sequence selected from the base sequence of SEQ ID NOS:69-236 which is able to induce or promote skipping of exon 7, 44, 46, 51, 53, 59, or 67 of the DMD pre-mRNA of a patient.

9. A method for inducing or promoting skipping of exon 45 of DMD pre-mRNA in a patient, the method comprising providing said patient with the molecule of claim 1.

10. The method according to claim 9, wherein the patient is provided with a functional dystrophin protein and/or wherein the production of an aberrant dystrophin protein in said patient is decreased, wherein the level of said functional dystrophin is assessed by comparison to the level of said dystrophin in said patient at the onset of the method.

Description

LEGENDS TO THE FIGURE

[0082] FIG. 1. In human control myotubes, a series of AONs (PS220 to PS225; SEQ ID NO: 3 to 8), all binding to a continuous stretch of at least 21 nucleotides within a specific sequence of exon 45 (i.e. SEQ ID NO:2), were tested at two different concentrations (200 and 500 nM). All six AONs were effective in inducing specific exon 45 skipping, as confirmed by sequence analysis (not shown). PS220 (SEQ ID NO:3) however, reproducibly induced highest levels of exon 45 skipping (see FIG. 2). (NT: non-treated cells, M: size marker).

[0083] FIG. 2. In human control myotubes, 25-mer PS220 (SEQ ID NO: 3) was tested at increasing concentration. Levels of exon 45 skipping of up to 75% (at 400 nM) were observed reproducibly, as assessed by Agilent LabChip Analysis.

[0084] FIG. 3. In human control myotubes, the efficiencies of a “short” 17-mer AON45-5 (SEQ ID NO:68) and its overlapping “long” 25-mer counterpart PS220 were directly compared at 200 nM and 500 nM. PS220 was markedly more efficient at both concentrations: 63% when compared to 3% obtained with 45-5. (NT: non-treated cells, M: size marker).

EXAMPLES

Examples 1 and 2

Materials and Methods

[0085] AON design was based on (partly) overlapping open secondary structures of the target exon RNA as predicted by the m-fold program (Zuker, M. (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res., 31, 3406-3415), and on (partly) overlapping putative SR-protein binding sites as predicted by numerous software programs such as ESEfinder (Cartegni, L. et al. (2003) ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res, 31, 3568-71; Smith, P.J. et al. (2006) An increased specificity score matrix for the prediction of SF2/ASF-specific exonic splicing enhancers. Hum. Mol. Genet., 15, 2490-2508) that predicts binding sites for the four most abundant SR proteins (SF2/ASF, SC35, SRp40 and SRp55). AONs were synthesized by Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Netherlands), and contain 2′-O-methyl RNA and full-length phosphorothioate (PS) backbones.

Tissue Culturing, Transfection and RT-PCR Analysis

[0086] Myotube cultures derived from a healthy individual (“human control”) were obtained as described previously (Aartsma-Rus et al. Hum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14). For the screening of AONs, myotube cultures were transfected with 0 to 500 nM of each AON. The transfection reagent polyethylenimine (PEI, ExGen500 MEI Fermentas) was used according to manufacturer’s instructions, with 2 .Math.l PEI per .Math.g AON. Exon skipping efficiencies were determined by nested RT-PCR analysis using primers in the exons flanking exon 45. PCR fragments were isolated from agarose gels for sequence verification. For quantification, the PCR products were analyzed using the Agilent DNA 1000 LabChip Kit and the Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).

Results

[0087] A series of AONs targeting sequences within SEQ ID NO:2 within exon 45 were designed and tested in normal myotube cultures, by transfection and subsequent RT-PCR and sequence analysis of isolated RNA. PS220 (SEQ ID NO: 3) reproducibly induced highest levels of exon 45 skipping, when compared to PS221-PS225 (FIG. 1). High levels of exon 45 skipping of up to 75% were already obtained at 400 nM PS220 (FIG. 2). In a direct comparison, PS220 (a 25-mer) was reproducibly more efficient in inducing exon 45 skipping than its shorter 17-mer counterpart AON 45-5 (SEQ ID NO: 68; previously published as h45AON5 (Aartsma-Rus et al. Am J Hum Genet 2004;74: 83-92)), at both AON concentrations of 200 nM and 500 nM and with 63% versus 3% respectively at 500 nM (FIG. 3). This result is probably due to the fact that the extended length of PS220, in fact completely overlapping AON 45-5, increases the free energy of the AON-target complex such that the efficiency of inducing exon 45 skipping is also increased.

TABLE-US-00002 AONs in exon 45 SEQ ID NO: 3 (PS220) UUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUG 4 (PS221) AUUCAAUGUUCUGACAACAGUUUGC 5 (PS222) CCAGUUGCAUUCAAUGUUCUGACAA 6 (PS223) CCAGUUGCAUUCAAUGUUCUGACAA 7 (PS224) AGUUGCAUUCAAUGUUCUGA 8 (PS225) GAUUGCUGAAUUAUUUCUUCC 9 GAUUGCUGAAUUAUUUCUUCCCCAG 10 AUUGCUGAAUUAUUUCUUCCCCAGU 11 UUGCUGAAUUAUUUCUUCCCCAGUU 12 UGCUGAAUUAUUUCUUCCCCAGUUG 13 GCUGAAUUAUUUCUUCCCCAGUUGC 14 CUGAAUUAUUUCUUCCCCAGUUGCA 15 UGAAUUAUUUCUUCCCCAGUUGCAU 16 GAAUUAUUUCUUCCCCAGUUGCAUU 17 AAUUAUUUCUUCCCCAGUUGCAUUC 18 AUUAUUUCUUCCCCAGUUGCAUUCA 19 UUAUUUCUUCCCCAGUUGCAUUCAA 20 UAUUUCUUCCCCAGUUGCAUUCAAU 21 AUUUCUUCCCCAGUUGCAUUCAAUG 22 UUUCUUCCCCAGUUGCAUUCAAUGU 23 UUCUUCCCCAGUUGCAUUCAAUGUU 24 UCUUCCCCAGUUGCAUUCAAUGUUC 25 CUUCCCCAGUUGCAUUCAAUGUUCU 26 UUCCCCAGUUGCAUUCAAUGUUCUG 27 UCCCCAGUUGCAUUCAAUGUUCUGA 28 CCCCAGUUGCAUUCAAUGUUCUGAC 29 CCCAGUUGCAUUCAAUGUUCUGACA 30 CCAGUUGCAUUCAAUGUUCUGACAA 31 CAGUUGCAUUCAAUGUUCUGACAAC 32 AGUUGCAUUCAAUGUUCUGACAACA 33 UCC UGU AGA AUA CUG GCA UC 34 UGC AGA CCU CCU GCC ACC GCA GAU UCA 35 UUGCAGACCUCCUGCCACCGCAGAUUC AGGCUUC 36 GUUGCAUUCAAUGUUCUGACAACAG 37 UUGCAUUCAAUGUUCUGACAACAGU 38 UGCAUUCAAUGUUCUGACAACAGUU 39 GCAUUCAAUGUUCUGACAACAGUUU 40 CAUUCAAUGUUCUGACAACAGUUUG 41 AUUCAAUGUUCUGACAACAGUUUGC 42 UCAAUGUUCUGACAACAGUUUGCCG 43 CAAUGUUCUGACAACAGUUUGCCGC 44 AAUGUUCUGACAACAGUUUGCCGCU 45 AUGUUCUGACAACAGUUUGCCGCUG 46 UGUUCUGACAACAGUUUGCCGCUGC 47 GUUCUGACAACAGUUUGCCGCUGCC 48 UUCUGACAACAGUUUGCCGCUGCCC 49 UCUGACAACAGU UUGCCGCUGCCCA 50 CUGACAACAGUUUGCCGCUGCCCAA 51 UGACAACAGUUUGCCGCUGCCCAAU 52 GACAACAGUUUGCCGCUGCCCAAUG 53 ACAACAGUUUGCCGCUGCCCAAUGC 54 CAACAGUUUGCCGCUGCCCAAUGCC 55 AACAGUUUGCCGCUGCCCAAUGCCA 56 ACAGUUUGCCGCUGCCCAAUGCCAU 57 CAGUUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUC 58 AGUUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCC 59 GUUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCU 60 UUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUG 61 UUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUGG 62 UGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUGGA 63 GCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUGGAG 64 CCGCUGCCCAAUGCCAUCCUGGAGU 65 CGCUGCCCAAUGCCAUCCUGGAGUU 66 UGU UUU UGA GGA UUG CUG AA 67 UGUUCUGACAACAGUUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUGG 68 (45-5) GCCCAAUGCCAUCCUGG

TABLE-US-00003 AONs in exons 51, 53, 7, 44, 46, 59, and 67 SEQ ID NO: DMD Gene Exon 51 69 AGAGCAGGUACCUCCAACAUCAAGG 70 GAGCAGGUACCUCCAACAUCAAGGA 71 AGCAGGUACCUCCAACAUCAAGGAA 72 GCAGGUACCUCCAACAUCAAGGAAG 73 CAGGUACCUCCAACAUCAAGGAAGA 74 AGGUACCUCCAACAUCAAGGAAGAU 75 GGUACCUCCAACAUCAAGGAAGAUG 76 GUACCUCCAACAUCAAGGAAGAUGG 77 UACCUCCAACAUCAAGGAAGAUGGC 78 ACCUCCAACALTCAAGGAAGATJGGCA 79 CCUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAU 80 CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUU 81 CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG 82 UCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUU 83 CCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUC 84 CAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCU 85 AACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUA 86 ACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG 87 ACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAGUUTTGG 88 ACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG 89 CAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAGU 90 AUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAGUU 91 UCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAGUUU 92 UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU 93 CAAGGAAGAUGGCAUUUCUAGUUUG 94 AAGGAAGATJGGCALTUUTCUAGULTUGG 95 AGGAAGAUGGCAUUUCUAGUUUGGA 96 GGAAGAUGGCAUUUCUAGUUUGGAG 97 GAAGAUGGCAUUUCUAGUUUGGAGA 98 AAGAUGGCAUUUCUAGUUUGGAGAU 99 AGAUGGCAUUUCUAGUUUGGAGAUG 100 GAUGGCAUUUCUAGUUUGGAGAUGG 101 AUGGCAUUUCUAGUUUGGAGAUGGC 102 UGGCAUUUCUAGUUUGGAGAUGGCA 103 GGCAUUUCUAGUUUGGAGAUGGCAG 104 GCAUUUCUAGUUUGGAGAUGGCAGU 105 CAUUUCUAGUUUGGAGAUGGCAGUU 106 AUUUCUAGUUUGGAGAUGGCAGUUU 107 UUUCUAGUUUGGAGAUGGCAGUUUC 108 UUCUAGUUUGGAGAUGGCAGUUUCC DMD Gene Exon 53 109 CCAUUGUGUUGAAUCCUUUAACAUU 110 CCALTUGUGULTGAAUCCUULTAAC 111 AUUGUGUUGAAUCCUUUAAC 112 CCUGUCCUAAGACCUGCUCA 113 CUUUUGGAUUGCAUCUACUGUAUAG 114 CAUUCAACUGUUGCCUCCGGUUCUG 115 CUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUG 116 CAUUCAACUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUG 117 CUGAAGGUGUUCUUGUACUUCAUCC 118 UGUAUAGGGACCCUCCUUCCAUGACUC 119 AUCCCACUGAUUCUGAAUUC 120 UUGGCUCUGGCCUGUCCUAAGA 121 AAGACCUGCUCAGCUUCUUCCUUAGCUUCCAGCCA DMD Gene Exon 7 122 UGCAUGUUCCAGUCGUUGUGUGG 123 CACUAUUCCAGUCAAAUAGGUCUGG 124 AUUUACCAACCUUCAGGAUCGAGUA 125 GGCCUAAAACACAUACACAUA DMD Gene Exon 44 126 UCAGCUUCUGUUAGCCACUG 127 UUCAGCUUCUGUUAGCCACU 128 UUCAGCUUCUGUUAGCCACUG 129 UCAGCUUCUGUUAGCCACUGA 130 UUCAGCUUCUGUUAGCCACUGA 131 UCAGCLTUCUGULJAGCCACUGA 132 UUCAGCUUCUGUUAGCCACUGA 133 CAGCUUCUGUUAGCCACUGAU 134 UUCAGCUUCUGUUAGCCACUGAU 135 UCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUU 136 UUCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUU 137 UCAGCLTUCUGULJAGCCACUGATJUA 138 UUCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUA 139 UCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUU AA 140 UUCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAA 141 UCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAA 142 UUCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAA 143 CAGCUUCUGUUAGCCACUG 144 CAGCUUCUGUUAGCCACUGAU 145 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUU 146 CAGCUUCUGUUAGCCACUGAUU 147 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUUA 148 CAGCUUCUGUUAGCCACUGAUUA 149 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAA 150 CAGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAA 151 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAA 152 CAGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAA 153 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAA 154 AGCUUCUGUUAGCCACUGATT 155 GCUUCUGUUAGCCACUGAUU 156 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUU 157 GCUUCUGUUAGCCACUGAUUA 158 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUUA 159 GCUUCUGUUAGCCACUGAUUAA 160 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAA 161 GCUUCUGLTUAGCCACUGAUUAAA 162 AGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAA 163 GCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAA 164 CCAUUUGUAUUUAGCAUGUUCCC 165 AGAUACCAUUUGUAUUUAGC 166 GCCAUUUCUCAACAGAUCU 167 GCCAUUUCUCAACAGAUCUGUCA 168 AUUCUCAGGAAUUUGUGUCUUUC 169 UCUCAGGAAUUUGUGUCUUUC 170 GUUCAGCUUCUGUUAGCC 171 CUGAUUAAAUAUCUTTUAUAUC 17 GCCGCCAUUUCUCAACAG 173 GUAUUUAGCAUGUUCCCA 174 CAGGAAUUUGUGUCUUUC DMD Gene Exon 46 175 GCUUUUCUUUUAGUUGCUGCUCUUU 176 CUUUUCUUUUAGUUGCUGCUCUUUU 177 UUUUCUUUUAGUUGCUGCUCUUUUC 178 UUUCUUUUAGUUGCUGCUCUUUUCC 179 UUCUUUUAGUUGCUGCUCUUUUCCA 180 UCUUUUAGUUGCUGCUCUUUUCCAG 181 CUUUUAGUUGCUGCUCUUUUCCAGG 182 UUUUAGUUGCUGCUCUUUUCCAGGU 183 UUUAGUUGCUGCUCUUUUCCAGGUU 184 UUAGUUGCUGCUCUUUUCCAGGUUC 185 UAGUUGCUGCUCUUUUCCAGGUUCA 186 AGUUGCUGCUCUUUUCCAGGUUCAA 187 GUUGCUGCUCUUUUCCAGGUUCAAG 188 UUGCUGCUCUUUUCCAGGUUCAAGU 189 UGCUGCUCUUUUCCAGGUUCAAGUG 190 GCUGCUCUUUUCCAGGUUCAAGUGG 191 CUGCUCUUUUCCAGGUUCAAGUGGG 192 UGCUCUUUUCCAGGUUCAAGUGGGA 193 GCUCUUUUCCAGGUUCAAGUGGGAC 194 CUCLTUUTUCCAGGUU-CAAGUGGGAUA 195 UCUUUUCCAGGUUCAAGUGGGAUAC 196 CUUUUCCAGGUUCAAGUGGGAUACU 197 UUUUCCAGGUUCAAGUGGGAUACUA 198 UUUCCAGGUUCAAGUGGGAUACUAG 199 UUCCAGGUUCAAGUGGGAUACUAGC 200 UCCAGGUUCAAGUGGGAUACUAGCA 201 CCAGGUlTCAAGUGGGAUACUAGCAA 202 CAGGUUCAAGUGGGAUACUAGCAAU 203 AGGUUCAAGUGGGAUACUAGCAAUG 204 GGUUCAAGUGGGAUACUAGCAAUGU 205 GUUCAAGUGGGAUACUAGCAAUGUU 206 UUCAAGUGGGAUACUAGCAAUGUUA 207 UCAAGUGGGAUACUAGCAAUGUUAU 208 CAAGUGGGAUACUAGCAAUGUUAUC 209 AAGUGGGAUACUAGCAAUGULJAUCU 210 AGUGGGAUACUAGCAAUGUUAUCUG 211 GUGGGAUACUAGCAAUGUUAUCUGC 212 UGGGAUACUAGCAAUGUUAUCUGCU 213 GGGAUACUAGCAAUGUUAUCUGCUU 214 GGAUACUAGCAAUGUUAUCUGCUUC 215 GAUACUAGCAAUGUUAUCUGCUUCC 216 AUACUAGCAAUGUUAUCUGCUUCCU 217 UACUAGCAALTGLTUAUCUGCULTCCUC 218 ACUAGCAAUGUUAUCUGCUUCCUCC 219 CUAGCAAUGUUAUCUGCUUCCUCCA 220 UAGCAAUGUUAUCUGCUUCCUCCAA 221 AGCAAUGUUAUCUGCUUCCUCCAAC 222 GCAAUGUUAUCUGCUUCCUCCAACC 223 CAAUGUUAUCUGCUUCCUCCAACCA 224 AAUGUUAUCUGCUUCCUCCAACCAU 225 AUGUUAUCUGCUUCCUCCAACCAUA 226 UGUUAUCUGCUUCCUCCAACCAUAA 227 GUUAUCUGCUUCCUCCAACCAUAAA 228 GCUGCUCUUUUCCAGGUUC 229 UCUUUUCCAGGUUCAAGUGG 230 AGGUUCAAGUGGGAUACUA DMD Gene Exon 59 231 CAAUUUUUCCCACUCAGUAUU 232 UUGAAGUUCCUGGAGUCUU 233 UCCUCAGGAGGCAGCUCUAAAU DMD Gene Exon 67 234 GCGCUGGUCACAAAAUCCUGUUGAAC 235 CACUUGCUUGAAAAGGUCUACAAAGGA 236 GGUGAAUAACUUACAAAtlUUGGAAGC

TABLE-US-00004  SEQ ID NO: 1: Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly Pro Asp Leu Glu Asp 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Leu His Ser Trp Ile Thr Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Pro Glu Phe Ala Ile Phe Arg Lys Glu Gly Asn Phe Ser Asp Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Ile Glu Arg Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Ciln Asp Ala Ser Arg Ser Ala Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Lys Gln Ala Ser Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Ile Glu Phe Cys Gln Leu Leu Ser Glu Arg Leu Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Asn Ile Ile Ala Phe Tyr Asn Ciln Leu Ciln Gln Leu Glu Gln Met Thr Thr Thr Ala Glu Asn Trp Leu Lys Ile Gln Pro Thr Thr Pro Ser Glu Pro Thr Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys Ile Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu Ser Gly Leu Gln Pro Gln Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Ile Ala Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe Val Ala Phe Thr Asn His Phe Lys Gln Val Phe Ser Asp Val Gln Ala Arg Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met Arg Tyr Gln Glu Thr Met Ser Ala Ile Arg Thr Trp Val Gln Gln Ser Glu Thr Lys Leu Ser Ile Pro Gln Leu Ser Val Thr Asp Tyr Glu Ile Met Glu Gln Arg Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Gln Glu Gln Gln Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu Ser Thr Thr Val Lys Glu Met Ser Lys Lys Ala Pro Ser Glu Ile Ser Arg Lys Tyr Gln Ser Glu Phe Glu Glu Ile Glu Gly Arg Trp Lys Lys Leu Ser Ser Gln Leu Val Glu His Cys Gln Lys Leu Glu Glu Gln Met Asn Lys Leu Arg Lys Ile Gln Asn His Ile Gln Thr Leu Lys Lys Trp Met Ala Glu Val Asp Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp Ser Glu Ile Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln Cys Arg Leu Leu Val Ser Asp Ile Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu Asn Ser Val Asn Glu Gly Gly Gln Lys Ile Lys Asn Glu Ala Glu Pro Glu Phe Ala Ser Arg Leu Glu Thr Glu Leu Lys Glu Leu Asn Thr Gln Trp Asp His Met Cys Gln Gln Val Tyr Ala Arg Lys Glu Ala Leu Lys Gly Gly Leu Glu Lys Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Phe Glu Tyr Lys Thr Pro Asp Glu Leu Gln Lys Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala Lys Glu Glu Ala Gln Gln Lys Glu Ala Lys Val Lys Leu Leu Thr Glu Ser Val Asn Ser Val Ile Ala Gln Ala Pro Pro Val Ala Gln Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Glu Thr Leu Thr Thr Asn Tyr Gln Trp Leu Cys Thr Arg Leu Asn Gly Lys Cys Lys Thr Leu Glu Glu Val Trp Ala Cys Trp His Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val Glu Phe Lys Leu Lys Thr Thr Glu Asn Ile Pro Gly Gly Ala Glu Glu Ile Ser Glu Val Leu Asp Ser Leu Glu Asn Leu Met Arg His Ser Glu Asp Asn Pro Asn Gln Ile Arg Ile Leu Ala Gln Thr Leu Thr Asp Gly Gly Val Met Asp Glu Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu Thr Phe Asn Ser Arg Trp Arg Glu Leu His Glu Glu Ala Val Arg Arg Gln Lys Leu Leu Glu Gln Ser Ile Gln Ser Ala Gln Glu Thr Glu Lys Ser Leu His Leu Ile Gln Glu Ser Leu Thr Phe Ile Asp Lys Gln Leu Ala Ala Tyr Ile Ala Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln Met Pro Gln Glu Ala Gln Lys Ile Gln Ser Asp Leu Thr Ser His Glu Ile Ser Leu Glu Glu Met Lys Lys His Asn Gln Gly Lys Glu Ala Ala Gln Arg Val Leu Ser Gln Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys Leu Gln Asp Val Ser Met Lys Phe Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala Asn Phe Glu Gln Arg Leu Gln Glu Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu Val Lys Met His Leu Pro Ala Leu Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Asn His Cys Val Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu Val Glu Met Val Ile Lys Thr Gly Arg Gln Ile Val Gln Lys Lys Gln Thr Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Glu Arg Val Thr Ala Leu Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu Gly Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys Gln Gln Leu Glu Lys Cys Leu Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys Glu Met Asn Val Leu Thr Glu Trp Leu Ala Ala Thr Asp Met Glu Leu Thr Lys Arg Ser Ala Val Glu Gly Met Pro Ser Asn Leu Asp Ser Glu Val Ala Trp Gly Lys Ala Thr Gln Lys Glu Ile Glu Lys Gln Lys Val His Leu Lys Ser Ile Thr Glu Val Gly Glu Ala Leu Lys Thr Val Leu Gly Lys Lys Glu Thr Leu Val Glu Asp Lys Leu Ser Leu Leu Asn Ser Asn Trp Ile Ala Val Thr Ser Arg Ala Glu Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys His Met Glu Thr Phe Asp Gln Asn Val Asp His Ile Thr Lys Trp Ile Ile Gln Ala Asp Thr Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln Gln Lys Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Leu Asn Asp Ile Arg Pro Lys Val Asp Ser Thr Arg Asp Gln Ala Ala Asn Leu Met Ala Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Leu Val Glu Pro Gln Ile Ser Glu Leu Asn His Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met Asn Glu Asp Asn Glu Gly Thr Val Lys Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Ile Ser His Gln Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp Asp Leu Leu Lys Cys Leu Asp Asp Ile Glu Lys Lys Leu Ala Ser Leu Pro Glu Pro Arg Asp Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Lys Lys Lys Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg Arg Gln Ala Glu Gly Leu Ser Glu Asp Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Thr Gln Ile Gln Leu Ser Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu Ser Lys Phe Ala Gln Phe Arg Arg Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Met Val Met Thr Glu Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu Glu Val Glu Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His Ser Lys Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arg Val Lys Leu Gln Glu Ala Leu Ser Gln Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys Val Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr Asp Ile Lys Ile Phe Asn Gln Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu Arg Lys Thr Gln Ile Pro Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val Arg Thr Leu Asn Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala Ser Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Asn Leu Arg Trp Gln Glu Val Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys Arg Leu Glu Glu Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ser Ile Pro Leu Glu Pro Gly Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Val Lys Leu Leu Val Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile Ser Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr Asn Leu Gln Trp Ile Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln Gly Glu Ile Glu Ala Gln Ile Lys Asp Leu Gly Gln Leu Glu Lys Lys Leu Glu Asp Leu Glu Glu Gln Leu Asn His Leu Leu Leu Trp Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn Gln Glu Gly Pro Phe Asp Val Gln Glu Thr Glu Ile Ala Val Gln Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu Glu Ile Leu Ser Lys Gly Gln His Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala Thr Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp Lys Ala Val Asn Arg Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Lys Gln Pro Asp Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu Ser Leu Leu Asp Gln Val Ile Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg Ile Glu Arg Ile Gln Asn Gln Trp Asp Glu Val Gln Glu His Leu Gln Asn Arg Arg Gln Gln Leu Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu Glu Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln Ala Arg Ala Lys Leu Glu Ser Trp Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gln Trp Gln Thr Asn Val Asp Val Ala Asn Asp Leu Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile Asn Ala Ser Trp Arg Ser Ile His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu Ala Ala Leu Glu Glu Thr His Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu Pro Gin Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala Ser Ser Pro Gln Leu Ser His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu His Tyr Ala Ser Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ile Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile Gln His Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Gln Pro Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu Glu Ser Glu Glu Arg Gly Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gln Gln His Glu His Lys Gly Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro Glu Met Met Pro Thr Ser Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu Ile Ala Glu Ala Lys Leu Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu Ala Arg Met Gln Ile Leu Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser Gln Leu His Arg Leu Arg Gln Leu Leu Glu Gln Pro Glnthi Ala Glu Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly Ser Gln Thr Ser Asp Ser Met Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu Asn Asn Ser Phe Pro Ser Ser Arg Gly Arg Asn Thr Pro Gly Lys Pro Met Arg Glu Asp Thr Met